LAS TÉCNICAS HISTOLOGÍAS
Procedimientos dados en el Complejo Hospitalario Amador Guerrero.
Trabajo realizado por Abby Russo, Yaribeth Góndola y Demetrio Antonio
Para empezar con la técnica histológica se debe obtener una MUESTRA DEL TEJIDO a estudiar y existen 2 formas:
- Necropsia: Examen u obtención de tejido de un organismo muerto.
- Biopsia:(del griego bios = vida y oasis = visión) Examen u obtención de tejido de un organismo vivo. Puede ser inscisional, excisional, por sacabocado, por punción y absorción, por raspado, por trepanación.
I. Libros de registro
En el laboratorio de Patología se llevan varios libros que sirven de consulta y para varios propósitos. Todos los tejidos deben ser anotados en diferentes libros de registros, estos libros de registros pueden dividirse en:
A. Libro de biopsias
Inmediatamente que la muestra llega al laboratorio para su estudio se incluye en el libro de biopsias. En él han de consignarse los siguientes datos:
- Fecha de registro
- Número de biopsia.
- Número de Seguro Social del paciente.
- Nombre del médico solicitante.
- Apellido y nombre del paciente.
- Tipo de muestra.
- Lugar de procedencia de la muestra.
B. Libro de control de bloques
Diariamente, se hace un listado de los bloques que se
obtienen de los tejidos procesados en forma de listado secuencial. Se consigna el numero de la biopsia, cantidad de fragmentos incluidos y el número de bloques por biopsia. Toda esta información debe estar precedida por la fecha en que los tejidos fueron procesados.
C. Libro de control de cortes por congelación
Al llegar un corte por congelación al laboratorio, éste se registra, además de en el libro de biopsias, en lo que llamamos el libro de los
cortes por congelación que contendrá la información de todos los cortes por congelación. Se registran el número de biopsia que les corresponde, tipo de espécimen, cantidad de preparaciones, diagnóstico y fecha de realización.
D. Cuaderno de registro de casos procesados:
En este libro se lleva el control de los especimenes que en un periodo no mayor de un mes han sido diagnosticados. Los casos de interés diagnóstico se consignan para ser almacenados por un año. los casos negativos se descartan y se reutiliza el envase.
II. Procedimientos de rutina.
A Recibo de las muestras
Cada muestra que llega al laboratorio debe ser revisada para verificar que los datos de la solicitud del examen coinciden con los del recipiente donde viene 1a muestra. Las muestras son registradas en libro de biopsias donde recibirán un número que será su identificación en adelante.
Ejemplo: C-94-1. La C, la ubicación de la institución significa Colón, 94 el año en que fue recibida, seguido secuencialmente por el número de llegada, en nuestro ejemplo es la primera biopsia de ese año. En otras instituciones se utiliza, por ejemplo. D en David, Q en el Hospital Santo Tomás, etc.
En lugares donde trabaja más de un patólogo es necesario escribir en la solicitud de examen el nombre del patólogo al cual le corresponde trabajar el caso para posteriormente entregarle a este las laminillas que se obtengan de la muestra.
III Los procedimientos de la Técnica Histológica se resumen en las etapas siguientes:
A. Descripción macroscópicas de los tejidos
- Se ordenan las muestras en orden numérico ascendente.
- El técnico verifica con el patólogo los datos del recipiente contra la solicitud del examen.
- El patólogo dicta una descripción detallada de la apariencia del espécimen que es transcrita con claridad a la hoja de solicitud y elige una parte representativa del tejido, la cual mandará a procesar.
- Se anota el número de fragmentos de tejido que se procesarán.
- Cada muestra, después de tallada, estará debidamente identificada con su número de registro al llevarse al procesador de tejidos.
- Se procede a colocar todos los fragmentos que van a ser estudiados en el procesador automático de tejidos.
B. Procesamiento de tejidos:
La serie de pasos que implica esta técnica pueden realizarse manual o automáticamente. En el Complejo Hospitalario Metropolitano usamos procesadores automáticos de tejidos. Cada laboratorio, basado en su experiencia, establece los tiempos de inclusión en cada uno de los líquidos que se usan en el procesado.
Un espécimen traído al laboratorio es usualmente marcado con un número y nombre de identificación. Es copiada esta identificación con un lápiz suave en un área del bloque que va a ser procesado.
La superficie por donde las secciones han sido cortadas serán indicadas por la superficie opuesta o marcada con tinta china. Cuando el tejido es embebido en parafina, se marca la superficie del bloque en la parte superior, en celoidina descansa el contenido en el fondo haciendo que en la superficie del bloque de celoidina sea montado.
Los tejidos arreglados se mantienen en posición por un medio firme, por su tamaño delgado, las secciones uniformes pueden ser cortadas. El medio para este propósito es parafina, celoidina, nitrocelulosa y carbowax.
Embeberlo en parafina es resulta más rápido y se obtienen mejores resultados cuando se requieren secciones de tejido suave o delicado. La parafina no se disuelve con el agua, el tejido debe ser hidratado y luego limpiado en una solución que se disuelva en parafina.
En el laboratorio del departamento de patología se utiliza el procedimiento para procesar los tejidos con un equipo llamado procesador de tejidos.
En donde su horario de funcionamiento se estará explicando en la tabla más adelante.
HORARIO DE PROCESAMIENTO EN PARAFINA USADO POR LA AFIP
(Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas)
| PASO |
TIEMPO |
SOLUCIÓN |
| 1. | Período de Espera | 80% alcohol |
| 2. | 4:30 PM – 6:30 PM | 80% alcohol |
| 3. | 6:30 PM – 7:30 PM | 95% alcohol |
| 4. | 7:30 PM – 8:30 PM | 95% alcohol |
| 5. | 8:30 PM – 9:30 PM | 100% alcohol |
| 6. | 9:30 PM – 10:30 PM | 100% alcohol |
| 7. | 10:30 PM – 11:30 PM | 100% alcohol |
| 8. | 11:30 PM – 12:30 M | Cloroformo |
| 9. | 12:30 M – 2:30 AM | Cloroformo |
| 10. | 2:30 AM – 4:30 AM | Parafina |
| 11. | 4:30 AM – 6:30 AM | Parafina |
| 12. | 6:30 AM – 8:30 AM | Parafina |
Nota: Las soluciones en el procesador de tejidos debe ser cambiada dos veces cuando tiene un aproximado, cuando son llenadas dos canastas por uso.
A continuación se detalla el método que se utiliza en el laboratorio del Hospital Amador Guerrero, basado en el Manual de Histología de las Fuerzas Armadas.
| ETAPA | SOLUCIÓN EMPLEADA | TIEMPO |
| 1 Fijación | l. Formalina acuosa al 10% | 1 hora |
| 2. Formalina acuosa al 10% | 2 horas | |
| 2 Deshidratación | 3. Alcohol etílico al 80% | 1 hora |
| 4. Alcohol etílico al 95% | 1 hora | |
| 5. Alcohol etílico al 95% | 1 hora | |
| 6. Alcohol butílico | 1 hora | |
| 7. Alcohol butílico | 1 hora | |
| 3 Aclaramiento | 8. Xilol | ½ hora |
| 9. Xilol | ½ hora | |
| 4 Impregnación | 10. Paraplast | ½ hora |
| 11. Paraplast | 2 horas | |
| 12. Paraplast | 2 horas |
1 FIJACIÓN
Este proceso se refiere al tratamiento del tejido con sustancias químicas que tienen varias finalidades:
Conservar los tejidos de forma que muestren el mayor parecido posible a su estado in vivo.
Aumentar la dureza del tejido para facilitar la preparación de finas películas de éste.
Destruir bacterias y gérmenes que pudieran encontrarse en ellos.
Interrumpir los procesos celulares dinámicos que ocurren a la muerte de la célula.
Esto se logra al inactivar ciertas enzimas celulares que de otra manera iniciarían la Autolisis y llevarían a la DEGENERACIÓN POST MORTEM.
La fijación mantiene las estructuras al estimular la formación de enlaces cruzados entre las proteínas.
Los agentes más usados para Microscopia de Luz son:
Formaldehído al 5%, Formol al 10% o Formalina (Solución de Formaldehído especial)
- Puede usarse con amortiguadores o con otros fijadores.
- Reacciona con los grupos aminos de las proteínas, formando enlaces transversales y conservando las estructuras de la célula.
- Es el más usado es el Formol al 10%.
Regla de Oro para la Fijación
- La mejor fijación es cuando a pasado el menor tiempo entre la muerte del tejido y la fijación.
- Tamaño de la Muestra
- El tamaño de la muestra debe de ser de 2-3 cm. variando el estudio para lo cual de va a utilizar.
2 DESHIDRATACIÓN
Después que la muestra ha sido fijada se elimina el fijador y se deshidrata. Debido a que una gran parte del tejido está constituida por agua, se aplica una serie gradual de soluciones acuosas de menor a mayor de agente deshidratante, por ejemplo, Alcohol Etílico o Acetona. Iniciando con alcohol al 50 %, luego con una solución de 60%, 70%, 80%, 90%, 96% y alcanzando de manera paulatina el alcohol al 100 % para eliminar el agua. Esto se hace por que si se colocara el tejido en una solución al 100% de alcohol inmediatamente, el agua saldría muy rápido del tejido y se deformaría.
3 ACLARAMIENTO O DIAFANIZACIÓN
Luego de deshidratar el tejido, se pasa a una solución de una sustancia que es miscible tanto con el alcohol como con el medio de inclusión a utilizar (en la mayoría de los casos se utiliza como medio de inclusión Parafina líquida). La sustancia comúnmente utilizada es el Xileno o Xilol. De la misma manera se coloca la muestra de tejido en un recipiente de Xilol, el Xilol solo es soluble en alcohol al 100%. Se llama aclaramiento ya que el tejido se torna transparente o claro en el xileno, esto se debe a que cambia su índice de refracción. También se pueden utilizar Tolueno, Benzol o Cloroformo como medios de aclaramiento.
El alcohol y el xileno disuelven los lípidos de la célula y por lo cual al extraerse también se extraen las grasas y los lípidos de la célula.
4 INCLUSIÓN O IMPREGNACIÓN
A fin de que se puedan obtener cortes suficientemente finos para ser observados al microscopio, los tejidos tienen que ser incluidos y envueltos por una sustancia de consistencia firme. Las sustancias usadas para este fin son: gelatina o parafina.
El objeto de la inclusión es:
- Distinguir entre sí las células superpuestas en un tejido y la matriz extracelular.
- Tener un objeto lo suficientemente duro para su manejo y corte.
La inclusión se logra al infiltrar la parafina liquida o cualquier medio de inclusión en estado líquido al tejido, que disuelve el medio de aclaramiento y penetra en el tejido. Por lo general se coloca la muestra de tejido en un recipiente y se le agrega la parafina fundida a 60º C, colocando la muestra en una estufa de 30 minutos a 6 horas manteniendo la temperatura a 60º C.
Debido al calor, el xilol o el benzol se evaporan y los espacios anteriormente ocupados por ellos son ahora ocupados por la parafina. Después se coloca la pieza y un poco de parafina fundida en un molde de papel o metal de forma rectangular y se deja solidificar a temperatura ambiente, formándose un bloque sólido de parafina con el trozo de tejido incluido, a este bloque se le denomina Taco.
C. Bloqueo de los tejidos
Consiste en la confección de un bloque de parafina con el tejido en estudio incluido. Durante esta labor se tendrá en cuenta lo siguiente:
- Todos los bloques deben estar debidamente identificado con su número de biopsia.
- verificar los números de fragmentos con los que dice la solicitud del examen.
- Se utiliza una pinza para colocar para acomodar los bloques y los fragmentos.
- Hay que orientar el tejido de acuerdo a la estructura que se desee estudiar, ejemplo piel, quistes o cortes laminares, cérvix. biopsias gastrointestinales, etc.
Las muestras deben ser bloqueadas del lado para visualizar al microscopio todas las capas que constituyen el tejido. Los tejidos tubulares deben ser bloqueados de modo que al corte se pueda identificar la luz.
- Al bloquear se deben ordenar los tejidos sin amontonarlos, pues esto produce dificultad para cortarlos al micrótomo.
- Cuando se bloquea se debe tener cuidado de que no se forme doble capa entre la primera y la segunda parafina. Esto ocurre cuando se deja secar la parafina antes de rellenar el bloque.
D. Cortes histológicos
El taco ahora se puede cortar en secciones lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz. La mayor parte de los preparados para microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10 micrómetros. Para estos cortes se utiliza un aparato llamado MICROTOMO.
Cuando deseamos estudiar grasas o lípidos que se extraen en el proceso de aclaramiento o enzimas que quedan inactivadas por el calentamiento de la inclusión, nos auxiliamos con la Técnica de Congelación de Tejidos. Un tejido congelado, es los suficientemente duro para ser cortado.
Se sumerge la muestra de tejido en Nitrógeno líquido para tener una congelación rápida. Luego se corta con un aparato especial denominado MICROTOMO DE CONGELACIÓN, existe un aparato más elaborado y eficiente para los cortes de congelación llamado CRIOSTATO. La ventaja de esta técnica es que los cortes que se obtienen son muy rápidos, se puede utilizar en el diagnostico de material patológico, tomado en intervenciones quirúrgicas y el resultado se obtiene en el transcurso de una operación.
Para Microscopia Electrónica se requieren cortes más delgados (denominados ultra finos) de aproximadamente 25 a 100 nm. de espesor y de 0.5 mm. de lado medio. Para esto se utiliza un MICROTOMO CON HOJA DE VIDRIO O DIAMANTE. Una vez preparados, se montan sobre rejillas de cobre con un diámetro de 3mm.
Algunas recomendaciones para facilitar los cortes de los bloques:
- Verificar que el bloque esté firmemente sujeto al micrótomo.
- La cuchilla debe estar también bien sujeta al micrótomo.
- El bloque debe caer perpendicular al filo de la cuchilla, la cual debe estar muy bien afilada.
- El movimiento de rotación debe ser firme y uniforme.
- Para cortar tejidos duros como cérvix, tiroides, hernias, etc. se recomienda al cortar, efectuar movimientos firmes y rápidos.
- Para el corte de tejidos suaves como mucosas y ganglios, el movimiento de rotación debe ser lento y suave.
- La temperatura del baño de flotación debe ser tal que no llegue al punto de ebullición de la parafina, y que no esté tan fría que entorpezca el estiramiento del tejido; debe ser de aproximadamente 56 grados.
- Los bloques deben estar fríos para facilitar la labor del corte.
- Al obtener un corte completo y delgado se coloca en laminillas a las cuales se les ha aplicado una delgada capa de albúmina de Mayer y se rotulan con el número de biopsia que le correspondió.
- A las biopsias pequeñas se les hace directamente una rebaja y a biopsias de hígado y gástricas se les hace cortes extra para tinciones especiales. Este se hace para evitar que el material se haga insuficiente.
E. Montaje y compaginación
Los cortes todavía no son aptos para su examen con el microscopio, puesto que los tejidos se hallan infiltrados en parafina y carecen de color.
Los cortes se colocan sobre portaobjetos a los que se les ha agregado una pequeña cantidad de Albúmina, la cual actúa como adhesivo.
La parafina se elimina en un solvente orgánico, de nuevo se incluyen en Xilol, y la muestra se rehidrata haciéndola pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una solución 100% de agua.
Ya rehidratado se TIÑE EL TEJIDO. Los colorantes más utilizados son la HEMATOXILINA Y la EOSINA. Una vez teñido, se deshidrata de nuevo, de tal manera que pueda fijarse de modo permanente el CUBREOBJETOS con un medio adecuado para el MONTAJE (por ejemplo una gota de Bálsamo de Canadá o similar). Los medios de montaje pueden ser miscibles o no miscibles en agua, si son miscibles en agua ya no es necesaria la deshidratación después del teñido, se puede montarlo directamente. El cubreobjetos no solo protege el tejido, sino que se requiere para observar el corte con un microscopio.
Los colorantes pueden agruparse en 3 clases:
- Colorantes que diferencian los componentes ácidos y básicos de la célula.
- Colorantes especializados que distinguen los componentes fibrosos de la matriza extracelular.
- Sales metálicas que se precipitan en los tejidos y forman depósitos de metales con ellos.
Inmediatamente salen las laminillas de la tinción, se limpia el exceso de tinte y de xilol y se procede a colocarles el cubreobjetos usando como sellador una resina adecuada, cuidando de que no queden burbujas ni un exceso del Permount o resina. Luego se les coloca una etiqueta de papel engomado en la parte superior de la laminilla que es el mismo que el rótulo que tienen con lápiz de diamante y que la identifica.
Para la distribución de las laminillas, éstas se cotejan contra la hoja de solicitud en la que consta el número de biopsia, número de fragmentos incluidos y el nombre del patólogo a quien corresponde el caso.
Con esta tinción el núcleo de las células se tiñe de azul y el citoplasma se tiñe de rosado.
| # |
PASO |
SOLUCIÓN |
TIEMPO |
| 1 | Eliminación de xilol | Alcohol al 95% | 12 enjuagues |
| 2 | Hidratación | alcohol al 70% | 12 enjuagues |
| 3 | Hidratación | Agua | 12 enjuagues |
| 4 | Tinción nuclear | Hematoxilina | 5 minutos |
| 5 | Lavado | Agua | 12 enjuagues |
| 6 | Eliminación de exceso de colorante | alcohol ácido al 1% | |
| 7 | Lavado | Agua | 12 enjuagues |
| 8 | Cambio de pH | agua de amonio | cambio a azul |
| 9 | Lavado | Agua | 12 enjuagues |
| 10 | Deshidratación | alcohol al 70% | 12 enjuagues |
| 11 | Deshidrataron | alcohol al 95% | 12 enjuagues |
| 12 | Tinción citoplasmática | Eosina | 2 minutos |
| 13 | Aclaramiento | Butanol | 1 enjuague |
| 14 | Aclaramiento | Xilol | 4 enjuagues |
| 15 | Aclaramiento | Xilol | Hasta montaje |
IV. Procedimientos especiales:
A. Cortes por congelación
Para un diagnóstico inmediato durante el acto quirúrgico se realiza lo que se conoce como corte por congelación o corte transoperatorio. Para llevar a cabo dicha técnica se procederá de la siguiente forma:
- Registro inmediato de la biopsia en el libro de biopsias. al igual que en el libro de registro de cortes por congelación.
- Toma del dictado de la descripción macroscópica del espécimen que hace el patólogo.
- Tallado y congelación de parte representativa de la muestra por el patólogo
- Cortes con el criostato, que es un micrótomo en una cámara de congelación con una temperatura de – 20°. Rotular las laminillas con el número de biopsia que le correspondió.
- Si la muestra ha sido fijada con formalina debe lavarse con agua antes de efectuar el corte.
- Los cortes se pueden teñir con Terry o Paragon, que son tintes a base de azul de metileno o toluidina. ambas son tinciones rápidas, pero que tienen el inconveniente de que no son preparaciones permanentes pues se montan con agua. En ambos casos se le coloca una gota del tinte al corte, se lava rápidamente con agua comente y se le coloca el cubreobjetos.
Para una preparación permanente utilizamos una técnica modificada de hematoxilina-eosina que consiste de los siguientes pasos:
| a. Hematoxilina | 1 minuto. |
| b. Lave con agua. | |
| c. Alcohol ácido al 1% | 1 enjuague. |
| d. Agua | lave rápido. |
| e. Agua de amonio | viraje a azul de los cortes. |
| f. Lave con agua. | |
| g. Alcohol al 70% | 1 enjuague |
| h. Alcohol al 95% | 1 enjuague. |
| i. Eosina alcohólica | 1 minuto. |
| j. Butanol | 1 enjuague. |
| k. Xilol | 2 pasos de varios enjuagues. |
| 1. Seque y monte en resina o Permount. |
7. La temperatura del Criostato varía de acuerdo al tipo de tejido, pero por experiencia se ha demostrado que entre menos 18° a menos 20° se obtienen buenos resultados.
8. Para muestras muy pequeñas se utiliza una base de metal y O.C.T. (optimal cutting temperature), que es un medio de soporte como lo es la parafina para los cortes procesados. También se puede utilizar albúmina bovina al 20% o 30% y jarabe de goma de Von Apathy. Se recomienda usar base de metal en la orientación del tejido, para evitar la pérdida del mismo.
9. Para tejido adiposo se requiere una temperatura del criostato más baja (menos 35°) para ello se recomienda congelarlo con CO2 antes de llevarlo al criostato.
B Técnicas histológicas especiales
1. Rebajas: son cortes histológicos hechos a diferentes niveles de profundidad con respecto al corte original. Se obtienen tres cortes en una sola laminilla cuando el tejido es pequeño.
2. Cortes seriados: son cortes hechos 2 continuación del corte original, recogiendo todas las secciones que se obtengan.
3. Agotar el bloque: son múltiples cortes hechos a un bloque de tejido. hasta que éste se agote.
4. Girado de un bloque: al tejido ya cortado, se le cambia la orientación original, a solicitud del patólogo, puede ser girado a 90°, 80°, 160° o rebloquear para reorientar el tejido.
C. Tejidos que requieren tratamientos especiales.
1. Tejido Óseo: la pieza de tejido óseo, previamente lijada, se coloca en una solución decalcificadora, que puede ser ácido fórmico, ácido nítrico. Existen aparatos que sirven para eliminar el calcio del tejido por medio de comente eléctrica.
En nuestro laboratorio utilizamos el ácido nítrico al 5°’o como solución decalcificadora, la cual nos ha dado muy buen resultado. Dependiendo del tamaño del tejido, así mismo será el tiempo que se demore en !a solución decalcificadora, la cual tiene que ser cambiada con frecuencia hasta completar el proceso. Para verificar si la descalcificación ha sido completa se realiza la siguiente prueba: tome 5 mL. del líquido sobrenadante del recipiente donde está el tejido óseo, añada 5 mL. de hidróxido de amonio más 5 mL. de oxalato de amonio al 5%. si la solución se torna lechosa nos indica que el proceso de decalcificación no ha terminado. Se vuelve a poner el tejido en ácido nítrico al 5%, cambiándolo con frecuencia. Si al efectuar la prueba, la solución es clara, entonces ya la descalcificación ha terminado y es necesario entonces lavar la pieza para eliminar todo resto de ácido, ya que éste interfiere con la tinción nuclear.
2. Tejido adiposo: debido a que durante el procesado de rutina se usa alcohol y el tejido adiposo se disuelve con éste, para la demostración del mismo se hacen cortes por congelación y la grasa se tiñe con Sudán IV , III ó bien con Oil Red.
3. Ganglios linfáticos: es un tejido que presenta dificultad tanto para el diagnóstico, como para el corte, por lo tanto debe tenerse especial cuidado en su proceso.
a. Debe ser bien fijado, eliminando la grasa que le rodea.
b. Al bloquearlos se deben separar, de modo que no estén apretados entre sí.
c. .Al cortarlos en el micrótomo el movimiento debe ser lento y suave, de modo que el corte que se obtenga sea lo más delgado posible, de una sola capa de ocluías, para que el diagnóstico sea menos dificultoso.
4. Ojo: este tipo de tejido requiere un período de fijación largo y muchas veces por su tamaño requiere de la utilización de platos Petri para su Moqueo.
V. Preparación de Soluciones de rutina
- Hematoxilina:
Disuelva 5 gramos de hematoxilina en 50 mL de alcohol al 95% con la ayuda de calor, al colocar la mezcla sobre un plato caliente. Aparte, en la estufa, caliente 1000 mL. de agua destilada y añada 100 gramos de alumbre de potasio, una vez disueltos, agregue, sin bajar del fuego, la hematoxilina disuelta y lleve a ebullición. Baje el fuego y agregue lentamente 2.5 gramos de óxido rojo de mercurio, el cual debe estar envuelto en papel filtro, para evitar una reacción demasiado fuerte. Ponga a hervir esta mezcla probando el color sobre un papel filtro, retirando la solución del fuego al lograr un color púrpura intenso. Enfríe y filtre, añada 30 mL. de ácido acético para intensificar el color y 20 mL. de alcohol absoluto para evitar el crecimiento de hongos. La solución es estable entre 6 meses a un año.
- Eosina:
Disuelva 2 gramos de eosina en 800 mL. de alcohol etílico al 95% y añada 8 gotas de ácido acético para avivar el color.
Alcohol Ácido Alcohol etílico al 70%………….1000 mL.
Ácido clorhídrico…………………..10 mL.
Agua de amonio: Agua corriente…………………1000 mL.
Hidróxido de amonio………………3 mL.
Procedimiento de la tinción de hematoxilina-eosina
Una vez obtenidos los cortes histológicos, con las laminillas rotuladas en su parte inferior con lápiz de diamante, se secan en el horno a 58° a 60° por media hora y se pasan por dos baños de xilol de 5 minutos cada uno para eliminar la parafina. A continuación se procede a la tinción.
Datos importantes sobre la Tinción con hematoxilina-Eosina:
Es la técnica tintorial empleada en la rutina del laboratorio de histopatología y en la cual la hematoxilina se emplea en forma regresiva , es decir que el colorante se aplica en exceso y luego este es eliminado selectivamente con una solución diferenciadora, en este caso con alcohol ácido. Los componentes ácidos de la célula, como el núcleo, permanecen coloreados con la hematoxilina. La eosina, que es el colorante de contraste, permite observar los detalles del citoplasma.
Para la preparación de la hematoxilina hay que tener presente que- el colorante comercial (hematoxilón) no es un colorante activo y para que lo sea debe ser transformado en hematoma por medio de un proceso oxidativo. La oxidación se puede lograr en forma espontánea, pero ese proceso es largo, de modo que para acelerarlo se usa un agente oxidativo, el oxido rojo de mercurio, que hará que la maduración sea inmediata. También se utiliza un mordiente, que facilitará la fijación del colorante sobre los tejidos.
Antes de usar la hematoxilina se debe eliminar el espejo que se forma en su superficie, con la ayuda de unas laminillas de vidrio.
VI. Manejo y mantenimiento de equipo.
En el laboratorio de Patología existen varios aparatos muy delicados que requieren de un manejo cuidadoso y de atenciones especiales que mejorarán su operatividad y alargarán su período de vida media.
- Procesador de tejidos: para obtener resultados óptimos en el procesado de tejidos se debe vigilar las condiciones de los reactivos y materiales que se utilizan en el. De acuerdo a su uso, los alcoholes deben ser cambiados cuando presenten síntomas de hidratación. El butanol se torna lechoso y el xilol adquiere un color amarillento al estar contaminados. La parafina de uso histológico al contaminarse adquiere el olor del xilol. Es importante mantener un nivel adecuado de los líquidos, para estar seguros de que cubrirán los tejidos que se van a procesar. Debe verificarse la temperatura de los baños de parafina. la cual debe ser de 58° a 60°. Para incrementar la vida media del procesador de tejidos hay que someterlo a una revisión periódica por el departamento de Bioelectrónica. Diariamente se debe limpiar la superficie externa totalmente, eliminando las salpicaduras de parafina con un trapo limpio y un poco de xilol.
- Platos calientes: se deben limpiar diariamente, manteniéndolos libres de salpicaduras de parafina. Periódicamente se deben abrir para liberarlos de residuos de parafina que hayan caído en su interior. Las partes de metal se limpian con xilol verificando su temperatura con frecuencia.
- Dispensador de parafina: su limpieza debe ser diaria y hay que efectuar una revisión periódica de su temperatura.
- Hornos: limpieza y revisión periódica de la temperatura. Si es posible, se debe usar un homo para secar las laminillas antes de teñirlas, colocando papel toalla en el fondo que recoja toda la parafina, que de lo contrario caería al interior del homo. Se usará otro homo para secar la cristalería y las placas ya leídas por el patólogo, las cuales deben estar secas antes de proceder a su archivo. Hay tinciones especiales que requieren el uso de hornos con ciertas temperaturas, para lo cual se usará un homo que tenga un buen control de temperatura.
- Micrótomos de rotación: limpieza diaria, eliminando la parafina, aceitado mensual siguiendo el esquema que reposa en el interior del micrótomo, engrasado bimensual.
- Cuchillas de micrótomo: diariamente al terminar cortar se debe limpiar la cuchilla con xilol para eliminar los restos de parafina y ponerle un poco de aceite para evitar la oxidación. .Antes de afilar la cuchilla, se observa su filo al microscopio para determinar los daños que tenga, lo que determinará la duración del afilado. Primero se usa un esmeril grueso para quitar las muescas más profundas, y después un esmeril fino para asentar el filo. Una vez afiladas, las cuchillas se limpian y se guardan con una capa de aceite para evitar la corrosión por óxido.
VII. Archivo de micropreparados y de bloques
- Archivo de las laminillas o micropreparados: estas se archivan de manera permanente en un orden numérico ascendente en muebles diseñados para tal fin. Para que la búsqueda posterior sea más fácil es buena práctica colocar cada decena de laminillas un papel con el número que sigue.
- Archivo de los bloques de parafina: se archivan también en orden numérico en muebles confeccionados para ese propósito. Luego de pasados diez años se sacan y se recupera el material reciclable. Se debe rotular cada cajón con los bloques que contiene para facilitar la labor de búsqueda posterior.
VIII. Procedimientos para reciclado de materiales.
Existen en el laboratorio de Histología ciertos materiales que pueden volver a utilizarse en lugar de desecharlos.
- Los anillos de inclusión: aquellos bloques de biopsias o autopsias, que luego de 10 años se eliminan del archivo, pasan a la etapa de reciclado durante la cual se desprende el tejido, guardando la parafina; el anillo es limpiado con ayuda de xilol borrando todo vestigio del número anterior y quedando el anillo listo para ser utilizado otra vez.
- Parafina: la parafina obtenida de los casos que salen del archivo de bloques, que es separada del tejido con ayuda de un cuchillo, se diluye en el homo y se filtra, con el fin de obtener una parafina limpia y pelara, lista para ser usada otra vez.
- El xilol: el xilol retirado de la tinción de hematoxilina-eosina puede ser utilizado en la limpieza de los platos calientes, hornos, procesador de tejidos y también en la limpieza de los anillos reciclados.
IX. NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE HISTOLOGÍA
La vida y seguridad de los técnicos que laboran en nuestros laboratorio se debe proteger tomando tas siguientes medidas:
- Antes de empezar una práctica debes conocer y entender los procesos que vas a realizar.
- No fumar ni comer dentro de las instalaciones del laboratorio.
- Utilizar batas, guantes y mascarillas.
- Lavarse las manos frecuentemente.
- Evitar pipetear con la boca.
- Mantener el área de trabajo limpia.
- Colocar extintores de incendio en áreas accesibles y mantener al personal entrenado en su uso, además de tener buenas salidas de emergencia.
- Manejar todas las muestras como si fueran de alto riesgo.
- Las áreas de corte de los especimenes, bloqueo, tinción, inclusión y montaje deben poseer, extractores para eliminar la concentración de gases tóxicos.
- Los ácidos deben almacenarse en lugares bajos para así evitar accidentes, pero si por descuido tocas o te cae algún producto, lávate en el área afectada con abundante agua.
- Poner especial cuidado al manipular las cuchillas de micrótomo, para evitar cortaduras corporales.
- Notificar inmediatamente al Departamento de Riesgos Profesionales todo accidente ocurra dentro de las instalaciones
- Utiliza la campana en las prácticas donde se desprendan gases venenosos.
- Abre el grifo antes de tirar por la pila los restos de una reacción o reactivo.
- Tira los residuos sólidos a la papelera.
- Todos los productos deben mezclarse en pequeñas cantidades y despacio.
- Al acabar dejar limpio y seco todo el área de trabajo.
BIBLIOGRAFÍA
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